- Регистрация
- 28 Мар 2018
- Сообщения
- 243
- Реакции
- 768
- Баллы
- 93
Анаболические андрогенные стероиды (AAS) входят в число препаратов, наиболее используемых спортсменами для улучшения физических характеристик, а также для эстетических целей. В ряде работ были показаны побочные эффекты ААС в разных органах и тканях. Например, AAS, как известно, подавляют гонадотропин-высвобождающий гормон, лютеинизирующий гормон и фолликулостимулирующий гормон. В этом исследовании исследуются эффекты нандролона на биосинтез тестостерона в клетках Лейдига с использованием различных методов, включая масс-спектрометрию, вестерн-блоттинг, конфокальную микроскопию и количественную ПЦР в реальном времени.
Полученные результаты показывают, что уровни тестостерона увеличиваются с концентрацией нандролона 3,9 мкМ и возвращаются к базальному уровню в дозе 15,6 мкМ нандролона. Инкремент тестостерона, индуцированного нандролоном, ассоциировался с повышением регуляции стероидогенного острого регуляторного белка (StAR) и снижения регуляции 17a-гидроксилазы / 17, 20 лиазы (CYP17A1). Вместо этого доза нандролона 15,6 мкМ приводила к снижению регуляции CYP17A1. Дальнейшие исследования in vivo, основанные на этих данных, необходимы для лучшего понимания взаимосвязи между нарушенным гомеостазом тестостерона и нарушениями репродуктивной системы у мужчин.
Nandrolone считается одним из наиболее распространенных AAS во всем мире (Shahidi, 2001 ; Hartgens and Kuipers, 2004 ). Он имеет структуру, очень похожую на тестостерон и включен в класс II AAS, который включает 19-нор-тестостерон-производные. Его свойства включают повышение тканевого строительства, поддержание силы и мышечной массы, либидо и здоровье костей. Эндогенный нандролон продуцируется в качестве побочного продукта во время биохимических трансформационных реакций, а его основной метаболит (нондростерон) может быть обнаружен в образцах мочи человека в диапазоне концентраций 0,01-0,14 мг / л (Reznik et al., 2001 ; Bjelic et al., 2014 ). Несмотря на положительные эффекты нандролона и его использование при лечении многих клинических состояний (Wood, 2004 ), введение нандролона крысам-самцам индуцирует апоптоз сперматогенных клеток (Shokri et al., 2010 ). Тем не менее, механизмы, лежащие в основе токсичности яичек, индуцированной нандролоном, еще не полностью поняты.
Тестостерон, как и другие андрогены, продуцируется внутри яичка специализированными стероидогенными клетками, известными как клетки Лейдига (Kostic et al., 2011 ). Производство этого гормона регулируется сложным нейроэндокринным механизмом, который включает в себя пульсирующее высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) и последующую активацию CAMP стероидогенного каскада. Многочисленные стероидогенные стимулы, а также внутричерепные факторы играют определенную роль в сложной регуляторной сети тестостерона (Wu et al., 2007 ; De Maddalena et al., 2012 ; Janjic et al., 2012 ). Холестерин является общим субстратом для всех типов биосинтеза стероидных гормонов (включая тестостерон), который начинается в цитозоле и завершается в митохондриях. Стероидогенный острый регуляторный белок (StAR) переносит холестерин во внутреннюю мембрану митохондрий и через мобилизацию и доставку из внешней во внутреннюю митохондриальную мембрану холестерин превращается в прегненолон цитохромом P450, семейство 11, подсемейство A, полипептид 1 ( CYP11A1) (Stocco et al., 2005 ). Прегненолон дополнительно метаболизируется до прогестерона митохондриальной или микросомальной гидрокси-дельта-5-стероиддегидрогеназой, 3-бета- и стероидной дельта-изомеразой 1 (HSD3B1). В клетках Лейдига созревание прогестерона в андростендионе катализируется 17a-гидроксилазой / 17, 20 лиазой (CYP17A1); Кроме того, превращение андростендиона в тестостерон зависит от активности 17b-гидроксистероиддегидрогеназы, стероиддегидрогеназы, специфичной для производства андрогенов
Целью этого исследования было исследование влияния нандролона на продукцию тестостерона клетками Лейдига путем оценки уровней и экспрессии основных ферментов, участвующих в биосинтезе тестостерона.
Тестостерон. Выработка тестостерона в клетках, обработанных концентрациями нандролона 3,9 и 15,6 мкМ в течение 48 часов. Вертикальная ось: уровни тестостерона (нг / мл). Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Базальные: необработанные клетки. Данные представлены как среднее ± SD четырехкратных экспериментов. * = P <0,001.
Рисунок 3
Влияние стимуляции нандролона на стероидогенные белки. (A) Репрезентативные обрезанные пятна для StAR (30 кДа), CYP11A1 (60 кДа), HSD3B1 (42 кДа) и CYP17A1 (55 кДа). Гели проводили в тех же экспериментальных условиях и в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. (B) Уровни относительной экспрессии StAR, CYP11A1, HSD3B1 и CYP17A1. Вертикальная ось: произвольные единицы (AU). Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Базаль: необработанные. Данные представлены как среднее ± SD трехкратных экспериментов. * = P <0,05.
Рисунок 4
Влияние добавок нандролона на уровни StAR и CYP17A1: конфокальные анализы. (A и B). Типичные микрофотографии иммунофлуоресцентного пятна для StAR (A) и CYP17A1 (B) в клетках, обработанных 3,9 и 15,6 мкМ нандролона. Базальные: необработанные клетки. Бар = 25 мкм. (C и D). Репрезентативные гистограммы количественного определения иммунофлюоресценции интенсивности окрашивания для StAR (C) и CYP17A1 (D). Интенсивность окрашивания выражалась как средняя интенсивность пикселя (PI), нормированная на площадь поперечного сечения (CSA), с использованием программного обеспечения для флуоресценции приложения Leica. Вертикальная ось: PI / CSA * 100. Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Данные представлены как среднее ± SD четырехкратных экспериментов. * = P <0,001.
Рисунок 5
Влияние нандролона на экспрессию гена StAR и CYP17A1 . qRT-ПЦР-оценка экспрессии гена StAR и CYP17A1 после стимуляции нандролоном при 3,9 и 15,6 мкМ. Графики показывают нормализацию с эталонными генами по методу Ливака (2- ΔΔCT ). Вертикальная ось: 2 -ΔΔCT . Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Базальные: необработанные клетки. Данные представлены как среднее ± SD трехкратных экспериментов. * = P <0,05.
Настоящее исследование демонстрирует, что введение нандролона препятствует биосинтезу тестостерона дозозависимым образом. Результаты показали значительное увеличение уровней тестостерона в культуральной среде клеток R2C, обработанных 3,9 мкМ нандролона, тогда как уровни этого гормона не изменялись при более высоких дозах (15,6 мкМ) нандролона по сравнению с базальным состоянием. Насколько нам известно, в настоящей статье впервые описывается влияние лечения нандролоном на биосинтез тестостерона в клетках Лейдига, и наши результаты подтверждают данные, имеющиеся в текущей литературе, о вредных последствиях нандролона на яичках.
Недавно было продемонстрировано, что нандролон декаонат в дозе 10 мг / кг / неделю в течение 8 недель вызывал снижение уровня тестостерона в сыворотке, снижение веса яичек и изменение характеристик сперматозоидов у крыс (Ahmed, 2015 ) , Введение нандролона у крыс определяет ряд морфологических изменений, таких как уменьшение числа и размера клеток Лейдига, вакуолизация цитоплазмы и осаждение капель липидов. Более того, с биохимической точки зрения он вызывает повреждение яичка, вызывая окислительный стресс, воспалительные цитокины, матриксные металлопротеиназы, молекулы клеточной адгезии, апоптотические маркеры и повреждение ДНК (Nagata et al., 1999 ; Noorafshan et al., 2005 ; Naraghi et al., 2010 ; Ahmed, 2015 ; Bjelic et al., 2015 ).
В нашей экспериментальной модели наиболее важные полученные данные показывают, что тестостерон увеличивается, когда клетки Лейдига стимулируются более низкой концентрацией нандролона (3,9 мкМ), но этот прирост исчезает, когда клетки обрабатываются более высокими концентрациями (15,6 мкМ). Эти изменения сопровождаются модификацией на уровне белка или гена некоторых основных факторов, участвующих в производстве тестостерона, таких как StAR и CYP17A1. Последние данные свидетельствуют о том, что нандролон способен влиять на биосинтез тестостерона. Интересно, что мы сообщали о некоторых расхождениях между уровнем белка и гена в определенных условиях. Эти различия могут быть вызваны рядом причин (включая правила miRNA, посттрансляционные модификации, деградацию белка и т. Д.), Которые в настоящее время находятся на стадии расследования. Однако наличие этих расхождений может указывать на то, что альтернативные (и, вероятно, неизвестные) маршруты биосинтеза тестостерона стимулируются нандролоном и должны быть дополнительно исследованы в будущих исследованиях.
В заключение наши результаты подтверждают гипотезу, что нандролон способен модифицировать продукцию тестостерона, препятствуя экспрессии StAR и CYP17A1 в клетках Лейдига. Дальнейшие исследования необходимы для лучшего понимания in vitro молекулярных механизмов, ответственных за эти изменения. Более того, данные, представленные здесь, также должны быть подтверждены в моделях in vivo, чтобы понять взаимосвязь между администрацией AAS и ухудшением яичка у людей.
ссылка на оригинальную статью
Effects of Nandrolone Stimulation on Testosterone Biosynthesis in Leydig Cells
Полученные результаты показывают, что уровни тестостерона увеличиваются с концентрацией нандролона 3,9 мкМ и возвращаются к базальному уровню в дозе 15,6 мкМ нандролона. Инкремент тестостерона, индуцированного нандролоном, ассоциировался с повышением регуляции стероидогенного острого регуляторного белка (StAR) и снижения регуляции 17a-гидроксилазы / 17, 20 лиазы (CYP17A1). Вместо этого доза нандролона 15,6 мкМ приводила к снижению регуляции CYP17A1. Дальнейшие исследования in vivo, основанные на этих данных, необходимы для лучшего понимания взаимосвязи между нарушенным гомеостазом тестостерона и нарушениями репродуктивной системы у мужчин.
Nandrolone считается одним из наиболее распространенных AAS во всем мире (Shahidi, 2001 ; Hartgens and Kuipers, 2004 ). Он имеет структуру, очень похожую на тестостерон и включен в класс II AAS, который включает 19-нор-тестостерон-производные. Его свойства включают повышение тканевого строительства, поддержание силы и мышечной массы, либидо и здоровье костей. Эндогенный нандролон продуцируется в качестве побочного продукта во время биохимических трансформационных реакций, а его основной метаболит (нондростерон) может быть обнаружен в образцах мочи человека в диапазоне концентраций 0,01-0,14 мг / л (Reznik et al., 2001 ; Bjelic et al., 2014 ). Несмотря на положительные эффекты нандролона и его использование при лечении многих клинических состояний (Wood, 2004 ), введение нандролона крысам-самцам индуцирует апоптоз сперматогенных клеток (Shokri et al., 2010 ). Тем не менее, механизмы, лежащие в основе токсичности яичек, индуцированной нандролоном, еще не полностью поняты.
Тестостерон, как и другие андрогены, продуцируется внутри яичка специализированными стероидогенными клетками, известными как клетки Лейдига (Kostic et al., 2011 ). Производство этого гормона регулируется сложным нейроэндокринным механизмом, который включает в себя пульсирующее высвобождение лютеинизирующего гормона (LH) и последующую активацию CAMP стероидогенного каскада. Многочисленные стероидогенные стимулы, а также внутричерепные факторы играют определенную роль в сложной регуляторной сети тестостерона (Wu et al., 2007 ; De Maddalena et al., 2012 ; Janjic et al., 2012 ). Холестерин является общим субстратом для всех типов биосинтеза стероидных гормонов (включая тестостерон), который начинается в цитозоле и завершается в митохондриях. Стероидогенный острый регуляторный белок (StAR) переносит холестерин во внутреннюю мембрану митохондрий и через мобилизацию и доставку из внешней во внутреннюю митохондриальную мембрану холестерин превращается в прегненолон цитохромом P450, семейство 11, подсемейство A, полипептид 1 ( CYP11A1) (Stocco et al., 2005 ). Прегненолон дополнительно метаболизируется до прогестерона митохондриальной или микросомальной гидрокси-дельта-5-стероиддегидрогеназой, 3-бета- и стероидной дельта-изомеразой 1 (HSD3B1). В клетках Лейдига созревание прогестерона в андростендионе катализируется 17a-гидроксилазой / 17, 20 лиазой (CYP17A1); Кроме того, превращение андростендиона в тестостерон зависит от активности 17b-гидроксистероиддегидрогеназы, стероиддегидрогеназы, специфичной для производства андрогенов
Целью этого исследования было исследование влияния нандролона на продукцию тестостерона клетками Лейдига путем оценки уровней и экспрессии основных ферментов, участвующих в биосинтезе тестостерона.
Тестостерон
Для определения секреции тестостерона среду собирали в конце инкубационного периода и затем анализировали. Рабочий раствор нандролона вызывал через 48 ч увеличение секретируемого тестостерона в клетках R2C, обработанных нандролоном 3,9 мкМ, по сравнению с базальным образцом ( Р <0,05) ( фиг.2). 2 ). Интересно, что более высокая концентрация (15,6 мкМ) не вызывала значительного увеличения тестостерона по сравнению с базальными значениями.
Тестостерон. Выработка тестостерона в клетках, обработанных концентрациями нандролона 3,9 и 15,6 мкМ в течение 48 часов. Вертикальная ось: уровни тестостерона (нг / мл). Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Базальные: необработанные клетки. Данные представлены как среднее ± SD четырехкратных экспериментов. * = P <0,001.
Уровни ферментов, участвующих в синтезе тестостерона
Лизаты клеток R2C, обработанных различными концентрациями нандролона, анализировали с помощью анализа вестерн-блоттинга для проверки влияния стимуляции нандролоном на уровни белков, участвующих в синтезе тестостерона. Наши результаты показали, что уровни StAR (рис. ( 3) 3 ) значительно увеличиваются в клетках R2C, обработанных нандролоном 3,9 мкМ, по сравнению с базальным и 15,6 мкМ ( Р <0,05). Эти результаты были подтверждены конфокальными анализами ( фиг.4А 4 А и С). Интересно, что уровни CYP17A1 снижались при лечении 15,6 мкМ нандролона по сравнению с базальным и 3,9 мкМ ( Р <0,05) (рис. ( Рис. 3 ). 3 ) Кроме того, эти результаты согласуются с конфокальными анализами (рис. 4B 4 B и D). Наконец, анализ вестерн-блоттинга для уровней белка CYP11A1 и HSD3B1 не показал никаких значительные различия между необработанными и обработанными клетками (рис. ( 3), 3 ), и эта дата также соответствовала конфокальному анализу (не показан).
Рисунок 3
Влияние стимуляции нандролона на стероидогенные белки. (A) Репрезентативные обрезанные пятна для StAR (30 кДа), CYP11A1 (60 кДа), HSD3B1 (42 кДа) и CYP17A1 (55 кДа). Гели проводили в тех же экспериментальных условиях и в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. (B) Уровни относительной экспрессии StAR, CYP11A1, HSD3B1 и CYP17A1. Вертикальная ось: произвольные единицы (AU). Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Базаль: необработанные. Данные представлены как среднее ± SD трехкратных экспериментов. * = P <0,05.
Рисунок 4
Влияние добавок нандролона на уровни StAR и CYP17A1: конфокальные анализы. (A и B). Типичные микрофотографии иммунофлуоресцентного пятна для StAR (A) и CYP17A1 (B) в клетках, обработанных 3,9 и 15,6 мкМ нандролона. Базальные: необработанные клетки. Бар = 25 мкм. (C и D). Репрезентативные гистограммы количественного определения иммунофлюоресценции интенсивности окрашивания для StAR (C) и CYP17A1 (D). Интенсивность окрашивания выражалась как средняя интенсивность пикселя (PI), нормированная на площадь поперечного сечения (CSA), с использованием программного обеспечения для флуоресценции приложения Leica. Вертикальная ось: PI / CSA * 100. Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Данные представлены как среднее ± SD четырехкратных экспериментов. * = P <0,001.
Экспрессия генов StAR и CYP17A1
Чтобы выяснить индуцированную нандолоном модификацию уровней StAR и CYP17A1, проводили qRT-PCR-анализ для обеих молекул. Результаты показали, что изменения обоих уровней белка были связаны с изменением экспрессии генов, как показано на рисунке Рисунок 5. 5 . В частности, экспрессия мРНК StAR значительно увеличилась ( рис.5А) 5 А), в то время как экспрессия мРНК CYP17A1 значительно снижалась ( фиг.5B) 5 B) в клетках, обработанных концентрациями 3,9 и 15,6 мкМ нандролона, по сравнению с базальными уровнями ( P <0,05).
Рисунок 5
Влияние нандролона на экспрессию гена StAR и CYP17A1 . qRT-ПЦР-оценка экспрессии гена StAR и CYP17A1 после стимуляции нандролоном при 3,9 и 15,6 мкМ. Графики показывают нормализацию с эталонными генами по методу Ливака (2- ΔΔCT ). Вертикальная ось: 2 -ΔΔCT . Горизонтальная ось: концентрация нандролона в мкМ. Базальные: необработанные клетки. Данные представлены как среднее ± SD трехкратных экспериментов. * = P <0,05.
Настоящее исследование демонстрирует, что введение нандролона препятствует биосинтезу тестостерона дозозависимым образом. Результаты показали значительное увеличение уровней тестостерона в культуральной среде клеток R2C, обработанных 3,9 мкМ нандролона, тогда как уровни этого гормона не изменялись при более высоких дозах (15,6 мкМ) нандролона по сравнению с базальным состоянием. Насколько нам известно, в настоящей статье впервые описывается влияние лечения нандролоном на биосинтез тестостерона в клетках Лейдига, и наши результаты подтверждают данные, имеющиеся в текущей литературе, о вредных последствиях нандролона на яичках.
Недавно было продемонстрировано, что нандролон декаонат в дозе 10 мг / кг / неделю в течение 8 недель вызывал снижение уровня тестостерона в сыворотке, снижение веса яичек и изменение характеристик сперматозоидов у крыс (Ahmed, 2015 ) , Введение нандролона у крыс определяет ряд морфологических изменений, таких как уменьшение числа и размера клеток Лейдига, вакуолизация цитоплазмы и осаждение капель липидов. Более того, с биохимической точки зрения он вызывает повреждение яичка, вызывая окислительный стресс, воспалительные цитокины, матриксные металлопротеиназы, молекулы клеточной адгезии, апоптотические маркеры и повреждение ДНК (Nagata et al., 1999 ; Noorafshan et al., 2005 ; Naraghi et al., 2010 ; Ahmed, 2015 ; Bjelic et al., 2015 ).
В нашей экспериментальной модели наиболее важные полученные данные показывают, что тестостерон увеличивается, когда клетки Лейдига стимулируются более низкой концентрацией нандролона (3,9 мкМ), но этот прирост исчезает, когда клетки обрабатываются более высокими концентрациями (15,6 мкМ). Эти изменения сопровождаются модификацией на уровне белка или гена некоторых основных факторов, участвующих в производстве тестостерона, таких как StAR и CYP17A1. Последние данные свидетельствуют о том, что нандролон способен влиять на биосинтез тестостерона. Интересно, что мы сообщали о некоторых расхождениях между уровнем белка и гена в определенных условиях. Эти различия могут быть вызваны рядом причин (включая правила miRNA, посттрансляционные модификации, деградацию белка и т. Д.), Которые в настоящее время находятся на стадии расследования. Однако наличие этих расхождений может указывать на то, что альтернативные (и, вероятно, неизвестные) маршруты биосинтеза тестостерона стимулируются нандролоном и должны быть дополнительно исследованы в будущих исследованиях.
В заключение наши результаты подтверждают гипотезу, что нандролон способен модифицировать продукцию тестостерона, препятствуя экспрессии StAR и CYP17A1 в клетках Лейдига. Дальнейшие исследования необходимы для лучшего понимания in vitro молекулярных механизмов, ответственных за эти изменения. Более того, данные, представленные здесь, также должны быть подтверждены в моделях in vivo, чтобы понять взаимосвязь между администрацией AAS и ухудшением яичка у людей.
ссылка на оригинальную статью
Effects of Nandrolone Stimulation on Testosterone Biosynthesis in Leydig Cells
